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5.1.4 犬瘟热病毒反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)诊断技术

根据犬瘟热病毒Onderstepoort弱毒株F基因的序列,遵循引物设计的原则,科研人员选择了能扩增F蛋白融合区部位基因片段的一对引物,位于F1蛋白的N'末端,Primer 1(P1)(位于F基因mRNA的第773~792 bp)5'-ACTTGCAGGTGTAGCTTTAGG-3';P2(位于F基因的第1095~1075 bp)5'-AATAGGATCACGTAAACTCGG-3'。P2为病毒的基因序列。

1.细胞总RNA的分离

按照“异硫氰酸胍-酚-仿抽提分离RNA一步法”,参照Promega公司生产的细胞总RNA分离试剂盒的说明书进行细胞总RNA的分离。

2.反转录生成cDNA的第一条链

按常规方法加入P1和P2 进行反转录生成cDNA的第一条链。

3.PCR 扩增条件

科研人员对PCR循环参数和PCR反应体系中各要素用量进行了选择,最后确定PCR的循环参数 ......     (共891字)    [阅读本文]>>

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