5.1.4 犬瘟热病毒反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)诊断技术
根据犬瘟热病毒Onderstepoort弱毒株F基因的序列,遵循引物设计的原则,科研人员选择了能扩增F蛋白融合区部位基因片段的一对引物,位于F1蛋白的N'末端,Primer 1(P1)(位于F基因mRNA的第773~792 bp)5'-ACTTGCAGGTGTAGCTTTAGG-3';P2(位于F基因的第1095~1075 bp)5'-AATAGGATCACGTAAACTCGG-3'。P2为病毒的基因序列。
1.细胞总RNA的分离
按照“异硫氰酸胍-酚-仿抽提分离RNA一步法”,参照Promega公司生产的细胞总RNA分离试剂盒的说明书进行细胞总RNA的分离。
2.反转录生成cDNA的第一条链
按常规方法加入P1和P2 进行反转录生成cDNA的第一条链。
3.PCR 扩增条件
科研人员对PCR循环参数和PCR反应体系中各要素用量进行了选择,最后确定PCR的循环参数 ...... (共891字) [阅读本文]>>